維生素A是人體所必須的營養(yǎng)素之一，維生素A具有很大生理功能作用。VA進(jìn)入機(jī)體后排泄效率不高，長期過量攝入可在體內(nèi)蓄積，引起VA過多癥。成年人長期每天攝入15000μg視黃醇當(dāng)量，即可出現(xiàn)中毒癥狀，主要癥狀為厭食、過度激惹、惡心、嘔吐、眼底水腫。*，肝中維生素A含量比較高，但對鵝肥肝檢測方面的研究較少，本研究在前人檢測維生素A的基礎(chǔ)上，通過比較不同維生素A前處理方法，利用液相色譜法檢測其含量。zui后選定*處理方法，該方法簡單、快速、準(zhǔn)確，適合肝類物質(zhì)中的維生素A的檢測。
1．化學(xué)試劑
石油醚（分析純），**（分析純），正己烷（色譜純)，異丙醇（分析純），無水硫酸鈉（分析純)，甲醇（色譜純），乙醇（分析純），氮?dú)猓ǚ治黾儯瑲溲趸洠ǚ治黾儯?，抗壞血酸（分析純），BHT（分析純），維生素A標(biāo)樣（Singma）
2．儀器
HPLC（LabAlliance），M440型紫外檢測器，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，超聲波，離心機(jī)，磁力攪拌器等
色譜柱：C18（250mm×4.6mm）5μ
檢測器波長：325nm
維生素A標(biāo)樣濃度：12.3IU/mL（處理方法同樣品）
3.處理方法
分別用三種方法處理樣品，比較方法優(yōu)劣。
3.1實(shí)驗(yàn)方法1
樣品處理：稱取10.0g均勻樣品，置于100ml具塞試管中，加適量40℃熱水溶解，搖振10min，加入15ml無水乙醇，1.0g抗壞血酸，搖振防結(jié)塊，再加入10ml皂化液（50%KOH），在75℃水浴中皂化30min，并不時(shí)搖動(dòng)。迅速冷卻至室溫，準(zhǔn)確加入25.0ml萃取液（**：石油醚=1：1，V：V），振蕩3min，再加入25ml蒸餾水，加塞，將試管倒轉(zhuǎn)反復(fù)10次，用轉(zhuǎn)速3000r/min離心管理新10min，仔細(xì)吸取上層有機(jī)相20.0ml與小試管中，通氮?dú)鉂饪s至干，準(zhǔn)確加入5.0ml甲醇，搖勻待測[7][8]。
檢測器波長：325nm，流動(dòng)相甲醇，進(jìn)樣量10μL，流速1.0mL/min。
3.2 實(shí)驗(yàn)方法2
樣品處理：稱取10.0g左右樣品于研缽中，加適量甲醇，BHT及石英砂研磨，轉(zhuǎn)移至皂化瓶中，加60mL乙醇，40mL50%KOH甲醇溶液，1.0mgBHT，60-75℃回流造化皂化40min。冷卻后用正己烷反復(fù)提取皂化液，多次水洗至中性后，用無水硫酸鈉脫水并定容至50mL5容量瓶中。取上述提取液5mL減壓蒸干，用1mL甲醇溶解，經(jīng)0.45μm濾膜待進(jìn)樣[9][10]。
檢測器波長：325nm，流動(dòng)相為正己烷：甲醇（87：13），進(jìn)樣量10μL，流速1.0mL/min。
3.3 實(shí)驗(yàn)方法3
樣品處理：樣品加入50%KOH氫氧化鉀皂化，用乙迷提取，合并三次醚相，從乙迷提取液中分取10mL用氮?dú)獯抵两桑瑲堅(jiān)眉状级ㄈ葜?0mL，過0.45μm濾膜待進(jìn)樣[11][12]。
檢測器波長：325nm，流動(dòng)相為100%甲醇，進(jìn)樣量10μL，流速1.0mL/min。
4．定量分析
定量方法為外標(biāo)法；色譜條件為HPLC分析法。儀器平衡30min后，將一定量的表揚(yáng)和樣品分別進(jìn)樣，然后得出VA的標(biāo)樣及樣品的峰面積。
5．結(jié)果與分析
5.1 不同處理方法所得HPLC圖
將鵝肝按照方法1進(jìn)行維生素A皂化，zui后將處理好的樣品進(jìn)行HPLC檢測，結(jié)果如圖1所示：
將鵝肝按照方法2進(jìn)行維生素A皂化，zui后將處理好的樣品進(jìn)行HPLC檢測，結(jié)果如圖2所示：
將鵝肝按照方法3進(jìn)行維生素A皂化，zui后將處理好的樣品進(jìn)行HPLC檢測，結(jié)果如圖3所示：
通過比較三種檢測方法，其中方法3檢測效果明顯較好，故確定方法3為zui終實(shí)驗(yàn)方法。以下是利用方法3進(jìn)行鵝肥肝和鵝肝醬VA的檢測結(jié)果。
5.2 標(biāo)準(zhǔn)樣品、鵝肥肝及鵝肝醬中維生素A檢測的HPLC圖
將標(biāo)準(zhǔn)樣品、鵝肥肝及鵝肝醬按照方法3進(jìn)行處理，進(jìn)樣分析，所得圖譜如圖4、圖5、圖6所示：
5.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性關(guān)系
分別配制不同濃度的5個(gè)標(biāo)樣，并將表揚(yáng)依次進(jìn)行分析，所得結(jié)果如下表：
表1 VA標(biāo)樣分析
編號 | VA標(biāo)樣的濃度/（IU/mL） | VA峰面積 |
1 | 10 | 231.26 |
2 | 20 | 497.45 |
3 | 30 | 743.78 |
4 | 40 | 965.14 |
5 | 50 | 1178.31 |
回歸方程為y=236.18x＋14.651相關(guān)系數(shù)為0.9978，由此說明此線性關(guān)系良好。zui低檢出限：如進(jìn)樣量為10μL，則zui低檢出限VA為1.2×10-9g。
5.4 鵝肥肝和鵝肝醬中維生素A 的含量及精密度實(shí)驗(yàn)
對同一樣品進(jìn)行重復(fù)5次測定，結(jié)果見表2。從變異系數(shù)看，具有良好的重現(xiàn)性，精密度符合要求。
表2 維生素A含量檢測表及精密度檢測
測量次數(shù) | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | M | SD | CV |
鵝肥肝VA含量（IU/g） | 17.24 | 17.08 | 17.22 | 17.18 | 17.08 | 17.16 | ±0.076 | 0.44% |
鵝肝醬VA含量（IU/g） | 3.43 | 3.43 | 3.48 | 3.37 | 3.44 | 3.43 | ±0.039 | 1.14% |
5.5 回收率實(shí)驗(yàn)
采用鵝肥肝作為本實(shí)驗(yàn)的本底樣品，添加一定量的標(biāo)準(zhǔn)樣品，測定回收率，結(jié)果見表3。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，VA的平均回收率為98.21%，說明該法具有較好回收率。
表3 鵝肥肝維生素A回收率的測定
組別 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
樣品中維生素A含量（μg/100mg) | 0.52 | 0.52 | 0.52 | 0.52 | 0.52 |
維生素A的添加量（mg） | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 |
回收測定量（mg/100mg） | 1.08 | 1.09 | 1.13 | 1.11 | 1.09 |
回收率（％） | 96.43 | 97.32 | 100.89 | 99.11 | 97.32 |
M平均回收率（%） | 98.21 | ||||
SD（%） | ±1.79 | ||||
CV | 1.82% |
6.小結(jié)
實(shí)驗(yàn)通過比較3種不同處理方法，確定了肝類物質(zhì)中VA的HPLC檢測方法；實(shí)驗(yàn)同時(shí)對鵝肥肝和鵝肝醬中的維生素A進(jìn)行了檢測，試驗(yàn)結(jié)果精密度較高，所采用的方法平均回收率達(dá)到98.21%，是較為準(zhǔn)確可靠的結(jié)果。
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